Un filtro de fluorescencia es un componente esencial en el microscopio de fluorescencia. Un sistema típico tiene tres filtros básicos: un filtro de excitación, un filtro de emisión y un espejo dicroico. Por lo general, se empaquetan en un cubo para que el grupo se inserte junto en el microscopio.
¿Cómo funciona un filtro de fluorescencia?
Filtro de excitación
Los filtros de excitación transmiten luz de una longitud de onda específica y bloquean otras longitudes de onda. Se pueden utilizar para producir diferentes colores ajustando el filtro para permitir que pase solo un color. Los filtros de excitación son de dos tipos principales: filtros de paso largo y filtros de paso de banda. El excitador suele ser un filtro de paso de banda que deja pasar sólo las longitudes de onda absorbidas por el fluoróforo, minimizando así la excitación de otras fuentes de fluorescencia y bloqueando la luz de excitación en la banda de emisión de fluorescencia. Como lo muestra la línea azul en la figura, la presión arterial es 460-495, lo que significa que solo puede pasar a través de la fluorescencia de 460-495 nm.
Se coloca dentro del camino de iluminación de un microscopio de fluorescencia y filtra todas las longitudes de onda de la fuente de luz excepto el rango de excitación del fluoróforo. La transmisión mínima del filtro dicta el brillo y la brillantez de las imágenes. Se recomienda un mínimo de 40% de transmisión para cualquier filtro de excitación, de manera que la transmisión sea idealmente >85%. El ancho de banda del filtro de excitación debe estar completamente dentro del rango de excitación del fluoróforo, de modo que la longitud de onda central (CWL) del filtro esté lo más cerca posible de la longitud de onda de excitación máxima del fluoróforo. La densidad óptica (OD) del filtro de excitación dicta la oscuridad de la imagen de fondo; OD es una medida de qué tan bien un filtro bloquea las longitudes de onda fuera del rango de transmisión o ancho de banda. Se recomienda una DO mínima de 3,0, pero lo ideal es una DO de 6,0 o más.
Filtro de emisiones
Los filtros de emisión sirven para permitir que la fluorescencia deseada de la muestra llegue al detector. Bloquean longitudes de onda más cortas y tienen una alta transmisión para longitudes de onda más largas. El tipo de filtro también está asociado a un número, por ejemplo BA510IF en la figura (filtro de barrera de interferencias), cuya designación se refiere a la longitud de onda al 50% de su transmisión máxima.
Las mismas recomendaciones para los filtros de excitación son válidas para los filtros de emisión: transmisión mínima, ancho de banda, OD y CWL. Un filtro de emisión con la combinación ideal de CWL, transmisión mínima y OD proporciona las imágenes más brillantes posibles, con el bloqueo más profundo posible y garantiza la detección de las señales de emisión más débiles.
Espejo dicroico
El espejo dicroico se coloca entre el filtro de excitación y el filtro de emisión en un ángulo de 45° y refleja la señal de excitación hacia el fluoróforo mientras transmite la señal de emisión hacia el detector. Los filtros dicroicos y divisores de haz ideales tienen transiciones bruscas entre la máxima reflexión y la máxima transmisión, con una reflexión >95% para el ancho de banda del filtro de excitación y una transmisión de >90% para el ancho de banda del filtro de emisión. Seleccione el filtro con la longitud de onda de intersección (λ) del fluoróforo en mente, para minimizar la luz parásita y maximizar la relación señal-ruido de la imagen fluorescente.
El espejo dicroico en esta figura es el DM505, llamado así porque 505 nanómetros es la longitud de onda al 50% de la transmisión máxima de este espejo. La curva de transmisión de este espejo muestra una alta transmisión por encima de 505 nm, una fuerte caída en la transmisión a la izquierda de 505 nanómetros y una reflectividad máxima a la izquierda de 505 nm, pero aún puede tener algo de transmisión por debajo de 505 nm.
¿Cuál es la diferencia entre los filtros de paso largo y de paso de banda?
Los filtros de fluorescencia se pueden dividir en dos tipos: de paso largo (LP) y de paso de banda (BP).
Los filtros de paso largo transmiten longitudes de onda largas y bloquean las más cortas. La longitud de onda de corte es el valor al 50% del pico de transmisión, y todas las longitudes de onda por encima del corte son transmitidas por los filtros de paso largo. Se utilizan frecuentemente en espejos dicroicos y filtros de emisiones. Los filtros de paso largo deben usarse cuando la aplicación requiere una recolección máxima de emisiones y cuando la discriminación espectral no es deseable o necesaria, lo que generalmente es el caso de sondas que generan una única especie emisora en muestras con niveles relativamente bajos de autofluorescencia de fondo.
Los filtros de paso de banda solo transmiten una determinada banda de longitud de onda y bloquean otras. Reducen la diafonía al permitir que solo se transmita la porción más fuerte del espectro de emisión de fluoróforos, reducen el ruido de autofluorescencia y, por lo tanto, mejoran la relación señal-ruido en muestras de autofluorescencia de fondo alto, que los filtros de paso largo no pueden ofrecer.
¿Cuántos tipos de juegos de filtros de fluorescencia puede suministrar BestScope?
Algunos tipos comunes de filtros incluyen filtros azules, verdes y ultravioleta. Como se muestra en la tabla.
| Conjunto de filtros | Filtro de excitación | Espejo dicroico | Filtro de barrera | Longitud de onda de la lámpara LED | Solicitud |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Método de anticuerpos fluorescentes ·Naranja acidina: ADN, ARN ·Auramina: bacilo tuberculoso ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rodamina, TRITC: Método de anticuerpos fluorescentes ·Yoduro de propidio: ADN · Solicitud de propuestas |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Observación de autofluorescencia ·DAPI: tinción de ADN ·Hoechest 332528, 33342: utilizado para tinción de cromosomas |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | ·Catecolaminas ·5-hidroxitriptamina ·Tetraciclina: Esqueleto, Dientes |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Flúor 633, Alexa Flúor 647 |
Los conjuntos de filtros que se utilizan en las adquisiciones de fluorescencia están diseñados en torno a las principales longitudes de onda utilizadas en las aplicaciones de fluorescencia, que se basan en los fluoróforos más utilizados. Por esta razón, también reciben el nombre del fluoróforo para el que están destinados a obtener imágenes, como cubos de filtro DAPI (azul), FITC (verde) o TRITC (rojo).
| Conjunto de filtros | Filtro de excitación | Espejo dicroico | Filtro de barrera | Longitud de onda de la lámpara LED |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-auramina | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Rojo Tejas | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| cereza | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
¿Cómo se elige un filtro de fluorescencia?
1. El principio de selección del filtro de fluorescencia es dejar que la luz de fluorescencia/emisión pase a través del extremo de la imagen en la medida de lo posible y bloquear completamente la luz de excitación al mismo tiempo, para obtener la relación señal-ruido más alta. Especialmente para la aplicación de excitación multifotónica y microscopio de reflexión interna total, el ruido débil también causará una gran interferencia en el efecto de imagen, por lo que el requisito de relación señal-ruido es mayor.
2. Conocer el espectro de excitación y emisión del fluoróforo. Para construir un conjunto de filtros de fluorescencia que genere una imagen de alta calidad y alto contraste con un fondo negro, los filtros de excitación y emisión deben lograr una alta transmisión con una ondulación mínima de la banda de paso sobre las regiones que corresponden a los picos o emisiones de excitación del fluoróforo.
3. Considere la durabilidad de los filtros de fluorescencia. Estos filtros deben ser impermeables a fuentes de luz intensa que generan luz ultravioleta (UV) que podría provocar un "quemado", particularmente del filtro excitador, ya que está sujeto a toda la intensidad de la fuente de iluminación.
Las diferentes imágenes de muestra fluorescentes
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Hora de publicación: 09-dic-2022